Основные принципы культивирования бактерий. Фазы размножения бактерий

Метаболизм микроорганизмов.

Для роста и размножения микроорганизмы нуждаются в веществах, используемых для построения структурных компонентов клетки и получения энергии. Метаболизм (т. е. обмен веществ и энергии) имеет две составляющих - анаболизм и катаболизм . Анаболизм - синтез компонентов клетки (конструктивный обмен ). Катаболизм - энергетический обмен, связан с окислительно - восстановительными реакциями, расщеплением глюкозы и других органических соединений, синтезом АТФ. Питательные вещества могут поступать в клетку в растворимом виде (это характерно для прокариот) - осмотрофы , или в виде отдельных частиц - фаготрофы .

Основным регулятором поступления веществ в бактериальную клетку является цитоплазматическая мембрана. Существует четыре основных механизма поступления веществ: - пассивная диффузия - по градиенту концентрации, энергонезатратная, не имеющая субстратной специфичности;

- облегченная диффузия - по градиенту концентрации, субстратспецифичная, энергонезатратная, осуществляется при участии специализированных белков пермеаз ;

- активный транспорт - против градиента концентрации, субстратспецифичен (специальные связывающие белки в комплексе с пермеазами), энергозатратный (за счет АТФ), вещества поступают в клетку в химически неизмененном виде;

- транслокация (перенос групп) - против градиента концентрации, с помощью фосфотрансферазной системы, энергозатратна, вещества (преимущественно сахара) поступают в клетку в форфорилированном виде.

Основные химические элементы - органогены , необходимые для синтеза органичеких соединений - углерод, азот, водород, кислород.

В зависимости от источника потребляемого углерода микробы подразделяют на аутотрофы (используют CO2) и гетеротрофы (используют готовые органические соединения). В зависимости от источника энергии микроорганизмы делят на фототрофы (энергию получают за счет фотосинтеза - например, цианобактерии) и хемотрофы (энергия добывается за счет химических, окислительно-восстановительных реакций). Если при этом донорами электронов являются неорганические соединения, то это литотрофы , если органические - органотрофы . Если бактериальная клетка в состоянии синтезировать все необходимые для жизнедеятельности вещества, то это прототрофы . Если бактерии нуждаются в дополнительных веществах (факторах роста), то это ауксотрофы. Основными факторами роста для труднокультивируемых бактерий являются пуриновые и пиримидиновые основания, витамины, некоторые (обычно незаменимые) аминокислоты, кровяные факторы (гемин) и др.

Дыхание микроорганизмов.

Путем дыхания микроорганизмы добывают энергию. Дыхание - биологический процесс переноса электронов через дыхательную цепь от доноров к акцепторам с образованием АТФ. В зависимости от того, что является конечным акцептором электронов, выделяют аэробное и анаэробное дыхание. При аэробном дыхании конечным акцептором электронов является молекулярный кислород (О 2), при анаэробном - связанный кислород (-NO 3 , =SO 4 , =SO 3).

По типу дыхания выделяют четыре группы микроорганизмов.

• 1. Облигатные (строгие) аэробы . Им необходим молекулярный (атмосферный) кислород для дыхания.
• 2. Микроаэрофилы нуждаются в уменьшенной концентрации (низком парциальном давлении) свободного кислорода. Для создания этих условий в газовую смесь для культивирования обычно добавляют CO 2 , например до 10 - процентной концентрации.
• 3. Факультативные анаэробы могут потреблять глюкозу и размножаться в аэробных и анаэробных условиях. Среди них имеются микроорганизмы, толерантные к относительно высоким (близких к атмосферным) концентрациям молекулярного кислорода - т. е. аэротолерантные, а также микроорганизмы которые способны в определенных условиях переключаться с анаэробного на аэробное дыхание.
• 4. Строгие анаэробы размножаются только в анаэробных условиях т. е. при очень низких концентрациях молекулярного кислорода, который в больших концентрациях для них губителен. Биохимически анаэробное дыхание протекает по типу бродильных процессов, молекулярный кислород при этом не используется.

Аэробное дыхание энергетически более эффективно (синтезируется большее количество АТФ).

В процессе аэробного дыхания образуются токсические продукты окисления (H 2 O 2 - перекись водорода, -О 2 - свободные кислородные радикалы), от которых защищают специфические ферменты, прежде всего каталаза, пероксидаза, пероксиддисмутаза . У анаэробов эти ферменты отсутствуют, также как и система регуляции окислительно-восстановительного потенциала (rH 2 ).

Основные методы создания анаэробных условий для культивирования микроорганизмов.

• 1. Физический - откачивание воздуха, введение специальной газовой безкислородной смеси (чаще - N 2 - 85%, CO 2 - 10%, H 2 - 5%).
• 2. Химический - применяют химические поглотители кислорода.
• 3. Биологический - совместное культивирование строгих аэробов и анаэробов (аэробы поглощают кислород и создают условия для размножения анаэробов).
• 4. Смешанный - используют несколько разных подходов.

Необходимо отметить, что создание оптимальных условий для строгих анаэробов - очень сложная задача. Очень непросто обеспечить постоянное поддержание безкислородных условий культивирования, необходимы специальные среды без содержания растворенного кислорода, поддержание необходимого окислительно-восстановительного потенциала питательных сред, взятие и доставка, посев материала в анаэробных условиях.

Существует ряд приемов, обеспечивающих более подходящие условия для анаэробов - предварительное кипячение питательных сред, посев в глубокий столбик агара, заливка сред вазелиновым маслом для сокращения доступа кислорода, использование герметически закрывающихся флаконов и пробирок, шприцев и лабораторной посуды с инертным газом, использование плотно закрывающихся эксикаторов с горящей свечой. Используются специальные приборы для создания анаэробных условий - анаэростаты. Однако в настоящее время наиболее простым и эффективным оборудованием для создания анаэробных и микроаэрофильных условий является система “Газпак” со специальными газорегенерирующими пакетами, действующими по принципу вытеснения атмосферного воздуха газовыми смесями в герметически закрытых емкостях.

Основные принципы культивирования микроорганизмов на питательных средах.

• 1. Использование всех необходимых для соответствующих микробов питательных компонентов.
• 2. Оптимальные температура, рН, rH 2 , концентрация ионов, степень насыщения кислородом, газовый состав и давление.

Микроорганизмы культивируют на питательных средах при оптимальной температуре в термостатах, обеспечивающих условия инкубации.

По температурному оптимуму роста выделяют три основные группы микроорганизмов.

• 1. Психрофилы - растут при температурах ниже +20 градусов Цельсия.
• 2. Мезофилы - растут в диапозоне температур от 20 до 45 градусов (часто оптимум - при 37 градусах С).
• 3. Термофилы - растут при температурах выше плюс 45 градусов.

Краткая характеристика питательных сред.

По консистенции выделяют жидкие, плотные (1,5 - 3% агара) и полужидкие (0,3 - 0,7 % агара) среды.

Агар - полисахарид сложного состава из морских водорослей, основной отвердитель для плотных (твердых) сред. В качестве универсального источника углерода и азота применяют пептоны - продукты ферментации белков пепсином, различные гидролизаты - мясной, рыбный, казеиновый, дрожжевой и др.

По назначению среды разделяют на ряд групп:

Универсальные (простые), пригодные для различных нетребовательных микроорганизмов (мясо - пептонный бульон - МПБ, мясо - пептонный агар - МПА);

Специальные - среды для микроорганизмов, не растущих на универсальных средах (среда Мак - Коя на туляремию, среда Левенштейна - Иенсена для возбудителя туберкулеза);

Дифференциально - диагностические - для дифференциации микроорганизмов по ферментативной активности и культуральным свойствам (среды Эндо, Плоскирева, Левина, Гисса);

Селективные (элективные) - для выделения определенных видов микроорганизмов и подавления роста сопутствующих - пептонная вода, селенитовая среда, среда Мюллера.

По происхождению среды делят на естественные, полусинтетические и синтетические.

Рост и размножение микроорганизмов.

Бактериальные клетки размножаются в результате деления. Основные стадии размножения микробов в жидкой среде в стационарных условиях:

Лаг-фаза (начальная стадия адаптации с медленным темпом прирости биомассы бактерий);

Экспоненциальная (геометрического роста) фаза с резким ростом численности популяции микроорганизмов (2 в степеии n);

Стационарная фаза (фаза равновесия размножения и гибели микробных клеток);

Стадия гибели - уменьшение численности популяции в связи с уменьшением и отсутствием условий для размножения микроорганизмов (дефицит питательных веществ, изменение рH, rH 2 , концентрации ионов и других условий культивирования).

Данная динамика характерна для периодических культур с постепенным истощением запаса питательных веществ и накоплением метаболитов.

Если в питательной среде создают условия для поддержания микробной популяции в экспоненциальной фазе - это хемостатные (непрерывные) культуры .

Характер роста бактерий на плотных и жидких питательных средах: сплошной рост, образование колоний, осадок, пленка, помутнение.

Чистая культура - популяция одного вида микроорганизмов.

Основные принципы получения чистых культур: механическое разобщение, рассев, серийные разведения, использование элективных сред, особых условий культивирования (с учетом устойчивости некоторых микробов к определенным температурам, кислотам, щелочам, парциальному давлению кислорода, рН и мн. др).

ОСНОВНЫЕ ПРИНЦИПЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ
Выращивание микроорганизмов на питательных средах называют культивированием (от лат. cultus – выращивание), а развившиеся в результате микроорганизмы – культурой. При развитии в жидкой среде культуры образуют суспензию, осадок или плёнку, а при развитии на плотной среде – колонии. Культура может быть чистой – содержать потомство клетки только одного вида и накопительной – состоять преимущественно из клеток одного вида микроорганизмов.
Внесение клеток микроорганизмов (посевного материала – инокулята) в стерильную питательную среду для получения чистой или накопительной культуры называют посевом . Перенесение уже выращенных клеток из одной среды в другую (стерильную) называют пересевом , или пассированием .
Обычно микроорганизмы выращивают при определенной постоянной температуре в термостатах (деревянных или металлических шкафах) или термостатных комнатах. В тех и других постоянная температура поддерживается с помощью терморегуляторов.
Культивирование при определенной температуре называется инкубацией , или инкубированием .
Выращивают микроорганизмы в стеклянной посуде: пробирках, колбах или чашках Петри. Для этого стеклянную посуду, не бывшую в употреблении, очищают от щёлочи кипячением в растворе, содержащем бихромат калия K 2 Cr 2 O 7 (6 %) или концентрированную серную кислоту Н 2 SO 4 (6 %).
В пробирках микроорганизмы культивируют как в жидких, так и на плотных средах. Жидкой средой для аэробных культур заполняют обычно 1/3 пробирки, для анаэробных 2/3. Если плотная среда в пробирках предназначена для последующего выращивания микроорганизмов, при подготовке к стерилизации её наливают на 1/3…1/4 объёма пробирок.
После стерилизации пробирки с ещё не застывшей средой раскладывают на ровной поверхности стола в наклонном (под небольшим углом) положении для получения скошенной поверхности агара. Это так называемые косяки – косые или скошенные среды.
Плотная среда, застывшая при вертикальном положении пробирки, называется столбиком . Столбики питательной среды, занимающей от 1/3 до 1/2 объёма пробирки, используют для посева культуры уколом . Столбики питательной среды, занимающие 2/3 объёма пробирки, после стерилизации применяют для заливки стерильных чашек Петри, предназначенных для микробиологических посевов.
Пробирки со средами и культурами во время работы устанавливают в штативы; пробирки со средами, подготовленными к стерилизации, помещают в проволочные корзины или металлические ведра с отверстиями; пробирки с культурами при инкубации или хранении – в картонные коробки.
При культивировании микроорганизмов в колбах используют только жидкие питательные среды. Для аэробных микроорганизмов среду наливают тонким слоем (например, 30 мл в колбы Эрленмейера на 100 мл), для анаэробных микроорганизмов колбу заполняют на 2/3 объёма.
В чашках Петри микроорганизмы культивируют лишь на плотных средах. Высота этой посуды – около 1,5 см, диаметр – от 8 до
10 см, причём диаметр верхней чашки (она служит крышкой) несколько больше диаметра нижней.
2.1 Техника посева и пересева культур микроорганизмов
Посев (и пересев) микроорганизмов проводят при соблюдении определенных правил стерильности, которые необходимо выполнять, чтобы предохранить исследуемую культуру от загрязнения посторонними микроорганизмами и не загрязнять окружающую среду исследуемыми культурами микроорганизмов.
2.1.1 Посев на плотные среды в чашки Петри
Посев в чашки Петри проводится поверхностным и глубинным способами.
2.1.1.1Поверхностный способ посева Стерильную твердую питательную среду расплавляют на водяной бане в колбе и охлаждают до температуры 50°С.
Вынимают чашки Петри из бумаги, в которой они стерилизовались, и ставят их на ровную горизонтальную поверхность.
Берут колбу с охлажденной до температуры 50°С питательной средой, вынимают ватную пробку, обжигают на пламени горелки края пробирки и держат ее в наклонном положении.
Приоткрывают крышку чашки Петри левой рукой, а правой рукой наливают среду на дно чашки Петри, заполняя всю ее поверхность (рисунок 1).

Рисунок 1 – Заливка чашки Петри агаром
Оставляют чашку Петри на столе до полного застывания среды, затем ставят в термостат на 15…20 мин для подсушивания.
Посев на чашки с агаром производят штрихом при помощи петли либо втиранием стеклянным или металлическим шпателем.
При посеве петлёй ею захватывают небольшое количество инокулята и легко проводят по поверхности агара, нанося ряд параллельных линий или волнообразную черту (посев штрихом).
При посеве шпателем его вынимают из бумаги и берут в правую руку. Приоткрывают крышку чашки Петри левой рукой и вносят в нее шпатель.
Размазывают каплю посевного материала (предварительно внесенную пипеткой или бактериологической петлёй) шпателем вращательными движениями по поверхности агаровой пластинки (рису-
нок 2). Надавливать шпателем на твердую среду не следует, так как можно ее повредить.

Рисунок 2 – Посев шпателем
2.1.1.2 Глубинный способ посева
Приоткрывают стерильную чашку Петри и помещают петлей или пипеткой каплю посевного материала на дно чашки.
Расплавляют агаризованную питательную среду в пробирке или колбе и охлаждают ее до температуры 45°С.
Обжигают края пробирки или колбы в пламени горелки и выливают среду в чашку Петри с внесенным посевным материалом, соблюдая правила стерильной работы.
Распределяют равномерно посевной материал в питательной среде, для чего осторожно круговыми движениями перемещают чашку Петри по поверхности стола.
Оставляют чашку Петри на столе до полного застывания среды.
Делают на чашке Петри надпись (число, название микроорганизма). Все посевы, выполненные описанными способами, помещают в термостат для выращивания микроорганизмов при температуре, благоприятной для их роста.
2.1.2 Посев уколом в столбик агара или желатина
Пробирку с агаром или желатином держат дном кверху. Материал, подлежащий посеву, берут платиновой иглой, которую отвесно вка-лывают в поверхность агара или желатина и продвигают по оси про-
бирки до самого дна. Иглу затем извлекают, обжигают и закрывают пробирку пробкой (рисунок 3).

Рисунок 3 – Посев уколом
2.1.3 Пересев из пробирки в пробирку
2.1.3.1 Пересев на скошенный агар
Зажигают горелку. Пересевы проводят над пламенем горелки, чтобы теплый воздух препятствовал осаждению микроорганизмов из окружающего воздуха и отчасти их уничтожал (рисунок 4).

а, е – стерилизация петли; б – стерилизация краев пробирки;
в, г – взятие и посев материала; д – закрывание пробирок пробками
Рисунок 4 – Пересев микроорганизмов из пробирки в пробирку
Берут в правую руку бактериологическую петлю, с помощью которой осуществляют пересев (петлю держат как карандаш).
Стерилизуют бактериологическую петлю в пламени горелки, прокаливая проволоку докрасна, и одновременно обжигают примыкающую к петле часть держателя, который будет вводиться в пробирку с культурой микроорганизмов. При прокаливании петлю держат в пламени почти вертикально, чтобы вся проволока была раскалена.
Обе пробирки, т.е. ту, из которой производится пересев, и ту, которая подлежит засеву, берут вместе и держат между большим и указательным и средним пальцами левой руки. Причем пробирку со стерильной средой размещают дальше от себя, а с культурой микроорганизмов ближе к себе.
Не выпуская бактериологической петли из правой руки, мизинцем и безымянным пальцем правой руки прижимают наружные концы ватных пробок к ладони и вынимают пробки из пробирок. Класть пробки на стол нельзя.
Слегка обжигают в пламени горелки края открытых пробирок.
Вводят в пробирку с культурой микроорганизмов петлю. Чтобы не повредить клетки микроорганизмов, петлю вначале охлаждают, прикасаясь к внутренней поверхности пробирки или к питательной среде, свободной от клеток микроорганизмов, и только после этого отбирают небольшое количество микробной массы.
Вынимают петлю и вводят ее в пробирку со стерильной питательной средой, избегая прикосновения со стенками пробирки.
Проводят петлей от дна вверх зигзагообразную или прямую
черту-штрих, слегка касаясь поверхности агара.
Обжигают ватные пробки и края пробирок одновременно в пламени и закрывают обе пробирки.
Обжигают петлю в пламени горелки.
2.1.3.2 Пересев культур микроорганизмов в жидкую среду
Из стерильной бумаги вынимают градуированную стерильную пипетку за верхний конец, берут пипетку средним и большим пальцами правой руки, не касаясь поверхности той части пипетки, которая будет вводиться в сосуд с жидкой средой.
Берут в левую руку пробирку (или колбу) с культурой микроорганизмов, выращенной в жидкой среде, и держат ее в вертикальном положении, чтобы не замочить пробку.
Открывают пробку, соблюдая все правила стерильности, описанные выше, и вводят пипетку в пробирку.
Набирают в пипетку суспензию микроорганизмов, закрывают пробкой пробирку (или колбу), вносят определенное количество суспензии в свежую стерильную питательную среду, соблюдая уже описанные правила предосторожности.
Пипетку помещают в сосуд с дезинфицирующим раствором (0,5…3%-ным водным раствором хлорамина или 3…5%-ным водным раствором фенола), не касаясь ею окружающих предметов.
Если пересев производят с помощью бактериологической петли, то материал, внесенный в жидкую питательную среду для посева, растирают на стенке пробирки ближе к жидкости и взбалтывают в ней.

Универсальным инструментом для производства посевов явля­ется бактериальная петля. Кроме нее, для посева уколом при­меняют специальную бактериальную иглу, а для посевов на чашках Петри - металлические или стеклянные шпатели. Для посевов жидких материалов наряду с петлей используют пасте­ровские и градуированные пипетки. Первые предварительно из­готовляют из стерильных легкоплавких стеклянных трубочек, которые вытягивают на пламени в виде капилляров. Конец ка­пилляра сразу же запаивают для сохранения стерильности. У пастеровских и градуированных пипеток широкий конец за­крывают ватой, после чего их помещают в специальные пеналы или обертывают бумагой и стерилизуют.

При пересеве бактериальной культуры берут пробирку в левую руку, а правой, обхватив ватную пробку IV и V пальцами, вынимают ее, пронося над пламенем горелки. Удерживая дру­гими пальцами той же руки петлю, набирают ею посевной ма­териал, после чего закрывают пробирку пробкой. Затем в пробирку со скошенным агаром вносят петлю с посевным материалом, опуская ее до конденсата в нижней ча­сти среды, и зигзагообразным движением распределяют мате риал по скошенной поверхности агара. Вынув петлю, обжигают край пробирки и закрывают ее пробкой. Петлю стерилизуют в пламени горелки и ставят в штатив. Пробирки с посевами над г писывают, указывая дату посева и характер посевного мате­риала (номер исследования или название культуры).

Посевы «газоном» производят шпателем на питательный агар в чашке Петри. Для этого, приоткрыв левой рукой крышку, пет­лей или пипеткой наносят посевной материал на поверхность питательного агара. Затем проводят шпатель через пламя горел­ки, остужают его о внутреннюю сторону крышки и растирают материал по всей поверхности среды. После инкубации посева появляется равномерный сплошной рост бактерий.

Питательной средой в микробиологии называют среды, содер­жащие различные соединения сложного или простого состава, которые применяются для размножения бактерий или других микроорганизмов в лабораторных или промышленных условиях.

Питательные среды готовят из продуктов животного или рас­тительного происхождения. Большое значение имеет наличие в питательной среде ростовых факторов, которые катализируют метаболические процессы микробной клетки (витамины груп­пы В, никотиновая кислота и др.).

Искусственные среды готовят по определенным рецептам из различных настоев или отваров животного или растительного про­исхождения с добавлением неорганических солей, угле­водов и азотистых веществ.

В бактериологической практике чаще всего используют сухие питательные среды, которые получают на основе достижений современной биотехнологии. Для их приготовления используют экономически рентабельное непищевое сырье: утратившие срок годности кровезаменители (гидролизин-кислотный гидролизат крови животных, аминопептид - ферментативный гидролизат крови; продукты биотехнологии (кормовые дрожжи, кормовой лизин, виноградная мука, белколизин). Сухие питательные среды могут храниться в течение длительного времени, удобны при транспортировке и имеют относительно стандартный состав.

По консистенции питательные среды могут быть жид­кими, полужидкими, плотными. Плотные среды готовят путем до­бавления к жидкой среде 1,5-2% агара, полужидкие - 0,3- 0,7 % агара. Агар представляет собой продукт переработки осо­бого вида морских водорослей, он плавится при температуре 80-86 °С, затвердевает при температуре около 40 °С и в застыв­шем состоянии придает среде плотность. В некоторых случаях для получения плотных питательных сред используют желатин (10-15%). Ряд естественных питательных сред (свернутая сы­воротка крови, свернутый яичный белок) сами по себе являются плотными.

По целевому назначению среды подразделяют на основные, элективные и дифференци­ально-диагностические.

К основным относятся среды, применяемые для выращивания многих бактерий. Это триптические гидролизаты мясных, рыбных продуктов, крови животных или казеина, из которых готовят жидкую среду - питательный бульон и плотную - пита­тельный агар. Такие среды служат основой для приготов­ления сложных питательных сред - сахарных, кровяных и др., удовлетворяющих пищевые потребности патогенных бак­терий.

Элективные питательные среды предназначены для избира­тельного выделения и накопления микроорганизмов определен­ного вида (или определенной группы) из материалов, содержа­щих разнообразную постороннюю микрофлору. При создании элективных питательных сред исходят из биологических особен­ностей, которые отличают данные микроорганизмы от большин­ства других. Например, избирательный рост стафилококков на­блюдается при повышенной концентрации хлорида натрия, хо­лерного вибриона - в щелочной среде и т. д.

Дифференциально-диагностические питательные среды при­меняются для разграничения отдельных видов (или групп) мик­роорганизмов. Принцип построения этих сред основан на том, что разные виды бактерий различаются между собой по биохи­мической активности вследствие неодинакового набора фермен­тов.

Особую группу составляют синтетические и полусинтетиче­ские питательные среды . В состав синтетических сред входят химически чистые вещества: аминокислоты, минеральные соли, углеводы, витамины. В полусинтетические среды дополнительно включают пептон, дрожжевой экстракт и другие питательные вещества. Эти среды чаще всего применяют в научно-исследова­тельской работе и в микробиологической промышленности при получении антибиотиков, вакцин и других препаратов.

В последние годы в целях экономии питательных сред и уско­ренной идентификации некоторых микроорганизмов (энтеробактерии, стафилококки, стрептококки и др.) применяются так на­зываемые микротест-системы(МТС). Они представляют собой полистироловые пластины с лунками, в которых содержатся сте­рильные дифференциально-диагностические среды. Стерилизацию МТС проводят УФ-облучением. Микротест-системы особенно удобны при массовых бактериологических исследованиях в практических лабораториях.

Страница 13 из 91

ОСНОВНЫЕ ПРИНЦИПЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

1. Посев на скошенный агар штрихом. Правой рукой берут петлю и прожигают ее на пламени горелки докрасна. Левой рукой между большим и указательным пальцами держат пробирку с агаром почти в горизонтальном положении, чтобы во время посева в нее не попадали микробы из воздуха. Легким вращательным движением освобождают ватную пробку и мизинцем правой руки, прижимая к ладони, вынимают ее из пробирки. Край пробирки слегка обжигают. Петлей забирают немного материала, содержащего микробов, и зигзагообразными движениями наносят на поверхность агара в пробирке. После произведенного посева петлю извлекают из Пробирки, обжигают ее края и закрывают ватной пробкой. Затем снова прожигают петлю в пламени горелки, чтобы уничтожить оставшихся на ней микробов.
2. Пересев на скошенный агар. Материал, содержащий микробов, также находится в пробирках. Для того чтобы сделать пересев из одной пробирки в другую, обе пробирки, т. е. ту, из которой производится посев, и ту, которая подлежит засеву, берут вместе и держат между большим и указательным и средним пальцами левой руки. Вынимают сначала пробки из пробирок по указанной выше методике, набирают материал и переносят материал на поверхность стерильного агара, где и производят посев, затем обжигают края пробирки и закрывают (рис. 33).
3. Посев на бульон. Посев на бульон или с бульона на бульон или агар делают так же, как и посев на агар, но все манипуляции следует производить осторожно, чтобы бульон не вылился из пробирки или не смочил ее краев. Материал, внесенный в бульон для посева, растирают на стенке пробирки ближе к жидкости и взбалтывают в бульоне. Пересев из бульона в бульон можно делать также при помощи стерильной пастеровской пипетки.
4. Посев в молоко и другие питательные (жидкие) среды производится так же, как и посев в бульон.
5. Посев уколом в столбик агара или желатины. Пробирку с агаром или желатиной держат дном кверху. Материал, подлежащий посеву, берут платиновой иглой, которую отвесно вкалывают в поверхность агара или желатины и продвигают по оси пробирки до самого дна. Иглу затем извлекают, обжигают и закрывают пробирку пробкой (рис. 34).

Во внешней среде и в организме человека микробы чаше всего встречаются в смеси с другими микробами. Для изучения свойств того или иного микроба (без чего не может быть поставлен диагноз) его нужно иметь в чистой культуре, т. е. приходится отделять его от других микробов, с которыми он смешан.

Рис. 33. Посев петлей.

Рис. 34. Посев уколом.

Рис. 35. Заливка чашки агаром.
Существуют следующие методы выделения чистых культур бактерий:
а) посев на среду в чашку Гейденрейха - Петри;
б) биологические методы (применение элективных сред, использование различных оптимальных температур, заражение лабораторных животных). Наиболее часто пользуются посевом исследуемого материала на среду в чашки Гейденрейха - Петри.

1. Техника посева на чашку Гейденрейха - Петри с застывшим агаром. Агар в колбах, флаконах, пробирках расплавляют в кипящей водяной бане. Затем агар охлаждают до 50-60° и разливают в чашки Гейденрейха - Петри. Чашки должны быть стерильными. Их устанавливают на горизонтальной поверхности, и из сосуда, содержащего расплавленный агар, вынимают пробку, края сосуда обжигают, после чего среду выливают в чашку (рис. 35). Крышку чашки приподнимают левой рукой с одной стороны, не открывая чашки полностью. Слегка наклоняя чашку в разные стороны, распределяют налитый в нее агар ровным слоем по всему дну. Когда агар затвердеет, чашки ставят в термостат вверх дном для подсушивания. Полезно также удалить стерильной ватой конденсационную воду, собирающуюся на крышке чашки. Посев на чашки с агаром производят штрихом при помощи петли или втиранием стеклянным шпателем. Для его изготовления стеклянную палочку необходимой толщины (4- 5 мм) вводят в пламя горелки, нагревают до размягчения, конец обжимают предварительно нагретыми плоскозубцами и придают форму треугольника (рис. 36). Практически удобнее пользоваться металлическими шпателями Дригальского.

Посев петлей производится следующим образом. Платиновой петлей набирают небольшое количество материала, легко проводят по поверхности агара, нанося ряд параллельных линий. Той же петлей, не набирая материала, вновь наносят штрихи на второй и третьей чашке с агаром. На первой чашке может получиться сплошной рост, тогда как на второй и третьей наблюдается рост единичных, изолированных колоний. Каждая колония представляет обособленное скопление однородных микробов. Можно также пользоваться одной чашкой, разделив ее на несколько секторов, нанеся линии деления по стеклу дна чашки.

Рис. 36. Шпатель Дригальского.
Каждый отдельный сектор будет заменять одну чашку. При последующем пересеве из колоний на косой агар или другую питательную среду получают чистую культуру.
При посеве шпателем на поверхность агара наносят петлей одну каплю исследуемого материала. Затем, приоткрыв чашку, прокаленным и остуженным стеклянным шпателем растирают каплю по всей поверхности, производя легкие поглаживающие движения по всей поверхности агара (рис. 37). Не обжигая шпателя, им же засевают вторую и третью чашки с агаром.

Рис. 37. Посев шпателем.

Биологические методы выделения чистых культур. Выделение чистых культур на основе различных биологических свойств бактерий широко проводится на специальных питательных средах. Например, специальные среды нашли широкое применение при выделении возбудителей кишечных инфекций. Добавление к питательной среде малахитового или бриллиантового зеленого, солей желчных кислот, значительных концентраций поваренной соли или лимоннокислых солей подавляет рост кишечной палочки и не влияет на размножение патогенных бактерий кишечнотифозной группы. Для выделения из мокроты и слизи культуры коклюшной палочки к питательной среде добавляют антибиотик пенициллин, который угнетает рост сопутствующей микрофлоры и в то же время не задерживает роста и размножения возбудителя коклюша. Для выделения холерного вибриона используют элективную среду - пептонную воду, а для выделения дифтерийной палочки - свернутую лошадиную сыворотку.

Для облегчения выделения чистых культур некоторых бактерий можно воспользоваться и тем, что они растут при различных температурных оптимумах. В качестве примера можно привести метод выделения чистой культуры кишечной палочки из воды путем выращивания посевов в термостате при температуре 43°, выделение возбудителя чумы из загрязненного материала путем выращивания при 20° и даже при 5°.
Наконец, следует указать, что рост некоторых патогенных бактерий (пневмококк, бациллы сибирской язвы, бактерии туляремии и др.) можно получить в чистой культуре, заражая лабораторных животных, чувствительных к тому или другому микробу. Например, для выделения культуры пневмококка из мокроты больного человека производится заражение белой мыши.

Термостат

Рис. 38. Термостаты.

Засеянную среду помещают в термостат, где температура наиболее благоприятна для выращивания микробов. Для патогенных микробов эта температура должна соответствовать температуре человеческого тела, т. е. 37°. Электрические термостаты с автоматическим регулированием температуры бывают различных размеров- от величины небольшого ящика до величины комнаты. Термостат для обычной бактериологической работы представляет собой шкаф с двойными стенками из металла или дерева, обшитый снаружи плохими проводниками тепла, например, пробкой, асбестом и т. п. (рис. 38). Термостат имеет двойную дверку, наружную, обшитую изолирующим слоем, и внутреннюю в виде рамки со стеклом. Внутри термостата устроены съемные полки из металлической сетки.

Физиология и принципы культивирования микроорганизмов.

Метаболизм микроорганизмов.

Для роста и размножения микроорганизмы нуждаются в веществах, используемых для построения структурных компонентов клетки и получения энергии. Метаболизм (т.е. обмен веществ и энергии) имеет две составляющих- анаболизм и катаболизм . Анаболизм- синтез компонентов клетки (конструктивный обмен ). Катаболизм- энергетический обмен, связан с окислительно- восстановительными реакциями, расщеплением глюкозы и других органических соединений, синтезом АТФ. Питательные вещества могут поступать в клетку в растворимом виде (это характерно для прокариот) — осмотрофы , или в виде отдельных частиц- фаготрофы .

Основным регулятором поступления веществ в бактериальную клетку является цитоплазматическая мембрана. Существует четыре основных механизма поступления веществ: -пассивная диффузия — по градиенту концентрации, энергонезатратная, не имеющая субстратной специфичности;

— облегченная диффузия — по градиенту концентрации, субстратспецифичная, энергонезатратная, осуществляется при участии специализированных белков пермеаз ;

— активный транспорт- против градиента концентрации, субстратспецифичен (специальные связывающие белки в комплексе с пермеазами), энергозатратный (за счет АТФ), вещества поступают в клетку в химически неизмененном виде;

— транслокация (перенос групп) — против градиента концентрации, с помощью фосфотрансферазной системы, энергозатратна, вещества (преимущественно сахара) поступают в клетку в форфорилированном виде.

Основные химические элементы- органогены , необходимые для синтеза органичеких соединений- углерод, азот, водород, кислород.

В зависимости от источника потребляемого углерода микробы подразделяют на аутотрофы (используют CO2) и гетеротрофы (используют готовые органические соединения). В зависимости от источника энергии микроорганизмы делят на фототрофы (энергию получают за счет фотосинтеза- например, цианобактерии) и хемотрофы (энергия добывается за счет химических, окислительно- восстановительных реакций). Если при этом донорами электронов являются неорганические соединения, то это литотрофы , если органические- органотрофы . Если бактериальная клетка в состоянии синтезировать все необходимые для жизнедеятельности вещества, то это прототрофы . Если бактерии нуждаются в дополнительных веществах (факторах роста), то это ауксотрофы. Основными факторами роста для труднокультивируемых бактерий являются пуриновые и пиримидиновые основания, витамины, некоторые (обычно незаменимые) аминокислоты, кровяные факторы (гемин) и др.

Дыхание микроорганизмов.

Путем дыхания микроорганизмы добывают энергию. Дыхание- биологический процесс переноса электронов через дыхательную цепь от доноров к акцепторам с образованием АТФ. В зависимости от того, что является конечным акцептором электронов, выделяют аэробное и анаэробное дыхание. При аэробном дыхании конечным акцептором электронов является молекулярный кислород (О 2), при анаэробном- связанный кислород (-NO 3 , =SO 4 , =SO 3).

Аэробное дыхание донор водорода H 2 O

Анаэробное дыхание

Нитратное окисление NO 3

(факультативные анаэробы) донор водорода N 2

Сульфатное окисление SO 4

(облигатные анаэробы) донор водорода H 2 S

По типу дыхания выделяют четыре группы микроорганизмов.

1.Облигатные (строгие) аэробы . Им необходим молекулярный (атмосферный) кислород для дыхания.

2.Микроаэрофилы нуждаются в уменьшенной концентрации (низком парциальном давлении) свободного кислорода. Для создания этих условий в газовую смесь для культивирования обычно добавляют CO 2 , например до 10- процентной концентрации.

3.Факультативные анаэробы могут потреблять глюкозу и размножаться в аэробных и анаэробных условиях. Среди них имеются микроорганизмы, толерантные к относительно высоким (близких к атмосферным) концентрациям молекулярного кислорода — т.е. аэротолерантные, а также микроорганизмы которые способны в определенных условиях переключаться с анаэробного на аэробное дыхание.

4.Строгие анаэробы размножаются только в анаэробных условиях т.е. при очень низких концентрациях молекулярного кислорода, который в больших концентрациях для них губителен. Биохимически анаэробное дыхание протекает по типу бродильных процессов, молекулярный кислород при этом не используется.

Аэробное дыхание энергетически более эффективно (синтезируется большее количество АТФ).

В процессе аэробного дыхания образуются токсические продукты окисления (H 2 O 2 — перекись водорода, -О 2 — свободные кислородные радикалы), от которых защищают специфические ферменты, прежде всего каталаза, пероксидаза, пероксиддисмутаза . У анаэробов эти ферменты отсутствуют, также как и система регуляции окислительно- восстановительного потенциала (rH 2 ).

Основные методы создания анаэробных условий для культивирования микроорганизмов.

1.Физический- откачивание воздуха, введение специальной газовой безкислородной смеси (чаще- N 2 — 85%, CO 2 — 10%, H 2 — 5%).

2.Химический- применяют химические поглотители кислорода.

3.Биологический- совместное культивирование строгих аэробов и анаэробов (аэробы поглощают кислород и создают условия для размножения анаэробов).

4.Смешанный- используют несколько разных подходов.

Необходимо отметить, что создание оптимальных условий для строгих анаэробов- очень сложная задача. Очень непросто обеспечить постоянное поддержание безкислородных условий культивирования, необходимы специальные среды без содержания растворенного кислорода, поддержание необходимого окислительно- восстановительного потенциала питательных сред, взятие и доставка, посев материала в анаэробных условиях.

Существует ряд приемов, обеспечивающих более подходящие условия для анаэробов- предварительное кипячение питательных сред, посев в глубокий столбик агара, заливка сред вазелиновым маслом для сокращения доступа кислорода, использование герметически закрывающихся флаконов и пробирок, шприцев и лабораторной посуды с инертным газом, использование плотно закрывающихся эксикаторов с горящей свечой. Используются специальные приборы для создания анаэробных условий- анаэростаты. Однако в настоящее время наиболее простым и эффективным оборудованием для создания анаэробных и микроаэрофильных условий является система “Газпак” со специальными газорегенерирующими пакетами, действующими по принципу вытеснения атмосферного воздуха газовыми смесями в герметически закрытых емкостях.

Основные принципы культивирования микроорганизмов на питательных средах.

1.Использование всех необходимых для соответствующих микробов питательных компонентов.

2.Оптимальные температура, рН, rH 2 , концентрация ионов, степень насыщения кислородом, газовый состав и давление.

Микроорганизмы культивируют на питательных средах при оптимальной температуре в термостатах, обеспечивающих условия инкубации.

По температурному оптимуму роста выделяют три основные группы микроорганизмов.

1.Психрофилы- растут при температурах ниже +20 градусов Цельсия.

2.Мезофилы- растут в диапозоне температур от 20 до 45 градусов (часто оптимум- при 37 градусах С).

3.Термофилы- растут при температурах выше плюс 45 градусов.

Краткая характеристика питательных сред.

По консистенции выделяют жидкие, плотные (1,5- 3% агара) и полужидкие (0,3- 0,7 % агара) среды.

Агар- полисахарид сложного состава из морских водорослей, основной отвердитель для плотных (твердых) сред. В качестве универсального источника углерода и азота применяют пептоны — продукты ферментации белков пепсином, различные гидролизаты- мясной, рыбный, казеиновый, дрожжевой и др.

По назначению среды разделяют на ряд групп:

— универсальные (простые), пригодные для различных нетребовательных микроорганизмов (мясо- пептонный бульон- МПБ, мясо- пептонный агар- МПА);

— специальные- среды для микроорганизмов, не растущих на универсальных средах (среда Мак- Коя на туляремию, среда Левенштейна- Иенсена для возбудителя туберкулеза);

— дифференциально- диагностические- для дифференциации микроорганизмов по ферментативной активности и культуральным свойствам (среды Эндо, Плоскирева, Левина, Гисса);

— селективные (элективные) — для выделения определенных видов микроорганизмов и подавления роста сопутствующих- пептонная вода, селенитовая среда, среда Мюллера.

По происхождению среды делят на естественные, полусинтетические и синтетические.

Рост и размножение микроорганизмов.

Бактериальные клетки размножаются в результате деления. Основные стадии размножения микробов в жидкой среде в стационарных условиях:

— лаг- фаза (начальная стадия адаптации с медленным темпом прирости биомассы бактерий);

— экспоненциальная (геометрического роста) фаза с резким ростом численности популяции микроорганизмов (2 в степеии n);

— стационарная фаза (фаза равновесия размножения и гибели микробных клеток);

— стадия гибели — уменьшение численности популяции в связи с уменьшением и отсутствием условий для размножения микроорганизмов (дефицит питательных веществ, изменение рH, rH 2 , концентрации ионов и других условий культивирования).

Данная динамика характерна для периодических культур с постепенным истощением запаса питательных веществ и накоплением метаболитов.

Если в питательной среде создают условия для поддержания микробной популяции в экспоненциальной фазе- это хемостатные (непрерывные) культуры .

Характер роста бактерий на плотных и жидких питательных средах: сплошной рост, образование колоний, осадок, пленка, помутнение.

Чистая культура — популяция одного вида микроорганизмов.

Основные принципы получения чистых культур: механическое разобщение, рассев, серийные разведения, использование элективных сред, особых условий культивирования (с учетом устойчивости некоторых микробов к определенным температурам, кислотам, щелочам, парциальному давлению кислорода, рН и мн.др).

принципы культивирования микроорганизмов. Как лечить болезнь? принципы культивирования микроорганизмов. Народные способы лечения и исцеления. Уникальные исцеляющие видео-сеансы.